Zając morski nie musi być producentem

Dolastatyna 15 należy do naturalnych produktów morskich, które zwróciły uwagę badaczy ze względu na aktywność przeciwnowotworową. Początkowo izolowano ją z zająca morskiego Dolabella auricularia. Taki wynik łatwo odczytać jako wskazanie producenta: skoro związek znaleziono w organizmie, można uznać, że właśnie on go wytworzył.

W przypadku zwierząt morskich sprawa bywa jednak bardziej złożona. Ich tkanki zawierają związki pobrane z pożywienia albo wytworzone przez mikroorganizmy żyjące z nimi w kontakcie. Sama obecność cząsteczki w próbce nie mówi jeszcze, który organizm dysponuje genami potrzebnymi do jej syntezy.

Późniejsze badania dostarczyły mocniejszych przesłanek dla cyjanobakteryjnego pochodzenia dolastatyny 15. W 2020 roku związek wyizolowano bezpośrednio z morskiej cyjanobakterii. W badaniach na komórkach nowotworowych, komórkach śródbłonka i modelu danio pręgowanego obserwowano działanie związane między innymi z destabilizacją mikrotubul oraz procesami zależnymi od HIF-1α. Były to wyniki przedkliniczne, a nie dowód skuteczności klinicznej u pacjentów (Journal of Natural Products).

Pozostawało pytanie bardziej podstawowe, ale kluczowe dla całej historii: która cyjanobakteria naprawdę produkuje tę cząsteczkę i jak zapisany jest jej szlak biosyntezy? Wykrycie związku w ekstrakcie zawierającym wiele organizmów nie wystarczało, by na nie odpowiedzieć.

Jak z próbki środowiskowej wyłonić producenta

Autorzy pracy opublikowanej w PNAS sięgnęli po próbki z Guam. Nie próbowali rozwiązać problemu wyłącznie przez wyhodowanie jednej czystej kultury. Zastosowali genomikę rozdzieloną na poziomie organizmów, czyli analizę pozwalającą przypisać fragmenty informacji genetycznej konkretnym składnikom złożonej wspólnoty mikroorganizmów.

Z tego materiału zrekonstruowano dwa kompletne i dwa prawie kompletne genomy przypisane do rodzaju Dapis. W każdym z nich znaleziono klaster genów odpowiadający strukturze dolastatyny 15. Taki klaster jest czymś więcej niż pojedynczym genem. Zawiera zestaw instrukcji, które mogą kodować kolejne enzymy potrzebne do zbudowania i zmodyfikowania cząsteczki.

W ten sposób połączono trzy poziomy informacji. W próbce środowiskowej wykryto konkretny produkt chemiczny. Następnie powiązano go z genomami organizmów należących do Dapis, a w tych genomach odnaleziono pasujący zestaw genów biosyntetycznych. To znacznie silniejsza podstawa do wskazania źródła niż sama obserwacja, że dolastatyna 15 występuje w materiale pochodzącym z morza.

Wniosek dotyczy rodzaju Dapis. Nie oznacza automatycznie, że każdy jego gatunek albo każda populacja wytwarza dolastatynę 15. Dostępne dane nie wskazują też jednego, wyizolowanego szczepu jako wyłącznego producenta. Publikacja identyfikuje biologiczne źródło na poziomie rodzaju, a następnie pokazuje, jak jego aparatura enzymatyczna może zbudować tak nietypowy produkt (publikacja w PNAS).

Enzymatyczna linia montażowa z nietypowym modułem

Sam klaster genów nie mówi jeszcze, jak powstaje cała cząsteczka. Dolastatyna 15 jest liniowym depsypeptydem. Łączy elementy peptydowe z wiązaniem estrowym, więc jej biosynteza wymaga zarówno składania kolejnych jednostek, jak i ich chemicznych modyfikacji.

Kluczową rolę odgrywa tu syntetaza nierybosomalnych peptydów, w skrócie NRPS. Można ją porównać do enzymatycznej linii montażowej, choć poszczególne stanowiska nie są identyczne. Kolejne domeny wybierają określony składnik, aktywują go i przyłączają do rosnącego produktu. Typowe domeny adenylacyjne są przystosowane przede wszystkim do pracy z aminokwasami.

Dolastatyna 15 zawiera jednak hydroksykwasowe elementy pochodzące z 2-ketokwasów. Ich włączenie wymaga innego rozwiązania. W opisanym szlaku znaleziono niekanoniczny, pięciodomenowy moduł NRPS z wbudowaną domeną aktywującą 2-ketokwasy. Dzięki takiej architekturze enzym może przygotować nietypową jednostkę budulcową i włączyć ją do peptydopodobnego szkieletu.

To właśnie architektura modułu wyjaśnia, jak organizm może tworzyć cząsteczkę, której skład nie pasuje do najprostszego schematu syntezy peptydu. Geny wskazują więc nie tylko potencjalny zestaw enzymów, lecz także sposób podziału pracy między nimi. W tym przypadku forma enzymu odpowiada chemicznemu problemowi, który trzeba rozwiązać podczas składania dolastatyny 15.

Ostatni etap: test funkcji enzymu

Identyfikacja klastra genów pozostawia jeszcze jedno pytanie. Czy przewidywana funkcja enzymu rzeczywiście zgadza się z jego działaniem? W przypadku O-metylotransferazy autorzy poszli o krok dalej niż analiza sekwencji. Przeprowadzili charakterystykę biochemiczną i strukturalną tego białka.

O-metylotransferaza katalizuje powstanie charakterystycznego fragmentu metoksypirolinonu, jednego z końcowych elementów modyfikujących szkielet dolastatyny 15. Wyniki pokazały, że enzym działa zgodnie z przewidywaniami, więc związek między genem a proponowanym szlakiem staje się funkcjonalny, a nie tylko oparty na podobieństwie sekwencji lub położeniu genu w klastrze.

Ten etap uzupełnia wcześniejszy obraz. Genomika wskazała organizm i zestaw instrukcji, architektura NRPS wyjaśniła składanie nietypowych jednostek, a test O-metylotransferazy sprawdził działanie jednego z enzymów modyfikujących produkt. Nie oznacza to jednak, że cały szlak został odtworzony w probówce ani że dolastatynę 15 można już praktycznie wytwarzać w wybranym organizmie gospodarzu.

Co odkrycie wyjaśnia, a czego jeszcze nie rozstrzyga

Praca porządkuje historię dolastatyny 15 na kilku poziomach naraz. Związek wcześniej znajdowano w dużym organizmie morskim, potem wyizolowano z cyjanobakterii, a teraz powiązano go z rodzajem Dapis, odpowiadającym mu klastrem genów i wybranymi enzymami szlaku. To zamyka ważną lukę między obserwacją chemiczną a wyjaśnieniem biologicznego pochodzenia cząsteczki.

Zakres tego wyniku wyznacza jednak materiał, z którego go uzyskano. Próbki pochodziły z Guam, a genomy zrekonstruowano na podstawie materiału środowiskowego. Nie można więc bez dodatkowych danych przenieść wniosku na wszystkie populacje Dapis, inne obszary geograficzne ani wszystkie warunki ekologiczne, w których ten rodzaj występuje.

Nie rozwiązano też problemu produkcji na dużą skalę. Odnalezienie klastra genów i scharakteryzowanie kilku elementów szlaku pokazuje, jak dolastatyna 15 powstaje w środowisku, ale nie dowodzi jeszcze, że cały proces da się odtworzyć in vitro, łatwo przenieść do organizmu gospodarza albo prowadzić w sposób opłacalny.

Podobnie należy oddzielić pochodzenie związku od jego zastosowania medycznego. Wcześniejsze badania wykazały aktywność dolastatyny 15 w układach komórkowych i modelach zwierzęcych. Nie są one dowodem skuteczności ani bezpieczeństwa klinicznego u ludzi. Nowe badanie odpowiada przede wszystkim na pytanie, kto i przy użyciu jakiego aparatu enzymatycznego wytwarza tę cząsteczkę. Dopiero na tej podstawie można sensownie badać, jak ją pozyskiwać i co dokładnie da się z nią zrobić.